01介紹

2003年嚴重(zhong)急性呼吸(xi)係統綜合症(SARS)在全(quan)世界造(zao)成了8000多例病例產生，死亡率約為10% (Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最後已(yi)知的爆(bao)發是在2004年北京的一個研究實(shi)驗(yan)室。

這種疾病的原因被確(que)定為一種新的人類冠狀病毒，很(hen)可(ke)能起源於麝(she)貓(miao)，潛(qian)在宿主可(ke)能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wang et al. 2006)。冠狀病毒是有包膜的單鏈(lian)RNA病毒，大小從60～220納米不等。它們可(ke)以感染鳥類和哺乳動物，包括人類，並通過氣溶膠或糞(fen)便-口腔途(tu)徑傳(chuan)播。冠狀病毒在爆(bao)發期間的迅速傳(chuan)播表明，人類冠狀病毒的主要傳(chuan)播方式是呼吸(xi)道飛沫；然而，沒(mei)有直接證據支(zhi)持(chi)這一點(Belshe 1984)。由於迄今為止人類冠狀病毒感染被認為是一種溫和的、自我限(xian)製的疾病，因此關於其在環(huan)境(jing)中的傳(chuan)播潛(qian)力的信息有限(xian)。

鑒於2003年3月在香港高層住(zhu)宅區爆(bao)發的涉(she)及(ji)300多人的SARS疫(yi)情(qing)與一個有缺(que)陷的有關(Peiris et al. 2003)，SARS疫(yi)情(qing)傳(chuan)播可(ke)能與水和廢水有關。SARS-CoV可(ke)在腸(chang)道內複製 (Leung et al. 2003)，這一事實(shi)使其成為一種可(ke)能的腸(chang)道病原體，而SARS病例中腹瀉的發生率在8%～73%之間(SARS流行病學工作組(zu)，2003)，這引起了人們對其潛(qian)在環(huan)境(jing)傳(chuan)播的關注。

Leung等人(2003)還報道，從SARS患者小腸(chang)中獲得的病毒培養(yang)物產量高於作為該病毒靶(ba)器官的肺組(zu)織。傳(chuan)染性病毒是從SARS患者感染後3周內的糞(fen)便中分離出來的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出現及(ji)其傳(chuan)播問題表明需要更多的信息，特別是冠狀病毒在水和廢水中的存活情(qing)況。本研究比較了代表性冠狀病毒和脊髓(sui)灰(hui)質炎病毒1型在自來水和廢水中的存活情(qing)況。

02材料和方法

貓(miao)傳(chuan)染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一種貓(miao)科動物的腸(chang)道冠狀病毒，在克蘭德爾裏(li)瑟貓(miao)腎細胞係(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和檢測。人冠狀病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一種呼吸(xi)道病毒，在胎(tai)兒肺成纖維(wei)細胞，MRC-5細胞係(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓(sui)灰(hui)質炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一種已(yi)知的在環(huan)境(jing)中非常穩定的人類腸(chang)道病毒，在布法羅綠猴腎(BGM)細胞係中繁殖和檢測。

在單層細胞中觀察(cha)到細胞致病作用(CPE)後，將感染細胞在-20℃冷凍和解凍三(san)次以釋放病毒。隨後在1000g離心10分鍾以除去細胞碎(sui)片，加入到9%聚乙二醇(相對分子質量8000)和0.5 M氯化鈉的病毒懸浮液(ye)中，並在4℃下攪拌過夜。

在10000g離心30分鍾後，用0.01 M磷酸鹽緩衝鹽水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重(zhong)懸至(zhi)原始病毒懸液(ye)體積的5%。然後將冠狀病毒進行效價測定並儲存在-80℃下。脊髓(sui)灰(hui)質炎病毒通過用等體積的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取進一步純化，乳化後以7500g離心15分鍾，隨後收集(ji)頂層水層，進行效價測定並在-80℃儲存。

自來水樣本是從實(shi)驗(yan)室的冷水龍頭中采集(ji)的。水源是地下水，水質參數: pH 7.8，溶解固體297mg/L，總有機碳0.1mg/L。在收集(ji)樣品之前，讓水流動3分鍾。在未過濾的自來水和通過0.2μm孔徑過濾器去除細菌的自來水中測定病毒存活率。

將自來水(30mL)加入到無(wu)菌的50mL聚丙烯離心管中，以減少附著在容(rong)器上的病毒損(sun)失。添(tian)加無(wu)菌硫代硫酸鈉至(zhi)最終濃度33μg/mL，以使水脫氯。渦旋後，將病毒添(tian)加到每個管中，最終濃度為105 TCID50/mL。再次渦旋離心管並立即取樣(零時間點)。然後將離心管儲存在4℃或室溫下(23℃)。室溫下儲存的離心管用鋁(lv)箔(bo)覆(fu)蓋，以防暴露在光線(xian)下。在1、3、6、10、15和21天後對離心管取樣，並將樣品在-80℃下冷凍，直到它們在細胞上被分析。

初級出水和剩(sheng)餘活性汙泥(二級)的樣品來自於美(mei)國(guo)亞(ya)利(li)桑那州(zhou)圖森市羅傑(jie)路，並收集(ji)在無(wu)菌聚丙烯瓶(ping)中。沉澱後收集(ji)初級出水，氯化前收集(ji)二級出水。該設施一級出水的典(dian)型水質參數為生物需氧量(BOD)和1懸浮固體(10～220mg/L)。通常相比初級出水，二級出水中的BOD和懸浮固體減少了90%～95%。

將出水(30mL)加入到無(wu)菌的50mL聚丙烯離心管中。在添(tian)加病毒之前，一級出水通過0.2μm孔徑的過濾器過濾，並且未經過濾的也(ye)進行測試(shi)。二級出水僅(jin)未經過濾的進行測試(shi)。然後將病毒添(tian)加到每個離心管中，最終濃度為105 TCID50/mL。將離心管渦旋，立即取樣(零時間點)。然後將離心管覆(fu)蓋並保(bao)持(chi)在室溫(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天後收集(ji)樣品，並將樣品在-80℃下冷凍直至(zhi)分析。

使用噬斑試(shi)驗(yan)或TCID50技術在細胞培養(yang)物上計數病毒。在6孔塑(su)料細胞培養(yang)板中，通過噬斑測定法(Payment and Trudel 1993)測定了PV-1的效價。這是一種直接定量方法，最低檢測限(xian)為10 pfu/mL。

將每種稀釋液(ye)接種在兩個孔中。在細胞培養(yang)中不形成斑塊(kuai)的，通過組(zu)織培養(yang)感染劑(ji)量50%技術(TCID50)在24孔塑(su)料細胞培養(yang)板中測定其效價(Payment and Trudel 1993)。這種技術確(que)定了顯(xian)示出CPE的50%的原液(ye)的稀釋度。取稀釋倍數的反對數，得到每毫升TCID50的病毒效價。

該方法的最低檢測值為每毫升3.7個病毒。將每種稀釋液(ye)接種在至(zhi)少8個孔中。在添(tian)加病毒之前，任何(he)來自測試(shi)水的樣品都(du)必(bi)須在細胞培養(yang)檢測之前過濾，以消(xiao)除細菌汙染。在pH為7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通過以阻斷可(ke)能吸(xi)附病毒的位點來製備具有聚醚(mi)碸(PES)膜的0.2 μm低蛋白結合Millex過濾器(Millipore, Billerica, MA)。所有實(shi)驗(yan)重(zhong)複三(san)次。

03結果和討論

表1顯(xian)示了三(san)種病毒在測試(shi)水中的存活天數。每種病毒的對數減少量由公式“lg N/N0”計算，其中N是指定日期的病毒效價，N0是時間為0的病毒效價。線(xian)性回歸的斜(xie)率用於確(que)定存活率；病毒效價下降99%和99.9%所需的時間(分別表示為T99和T99.9)。

影響(xiang)病毒在水中存活的因素包括溫度、有機物和好氧微生物(John and Rose 2005; Melnick and Gerba 1980; Sobsey and Meschke 2003)。對病毒存活最關鍵的影響(xiang)因素就(jiu)是溫度。已(yi)有研究表明，病毒存活率隨著溫度的升高而降低，這主要是由蛋白質變性和胞外酶活性增(zeng)加引起的(Hurst et al. 1980; John and Rose 2005)。自來水研究的結果證實(shi)冠狀病毒就(jiu)是這種情(qing)況。通過測試(shi)過濾後的自來水，我們減少或消(xiao)除了顆粒有機物和細菌的影響(xiang)。

在室溫下，隻需要10天就(jiu)能使過濾後的自來水中的冠狀病毒減少99.9%，而在4℃時，這種程度的病毒滅(mie)活則需要100天以上。PV-1在自來水中4℃的存活與冠狀病毒相似，但在室溫(23℃)下，該病毒在過濾水和未過濾水中的存活時間都(du)延長了六倍。

圖1和圖2分別顯(xian)示了三(san)種研究病毒在室溫(23℃)和4℃下在自來水中的存活情(qing)況。隨著時間的推移，病毒效價從4℃水中的初始效價上升，這可(ke)能是由於病毒傾(qing)向於形成聚集(ji)物然後分解，而不是由於病毒在樣本中的複製。

圖1室溫（23℃）條(tiao)件下三(san)種病毒在脫氯、過濾後自來水中的對數減少量

圖2 4℃條(tiao)件下三(san)種病毒在脫氯、過濾後自來水中的對數減少量（*代表未過濾）

水中有機物和懸浮固體的存在可(ke)以為吸(xi)附在這些顆粒上的病毒提供保(bao)護，但同(tong)時如果這些固體沉澱下來，也(ye)可(ke)以成為去除病毒的一種機製。從自來水到二級出水再到一級出水，測試(shi)水中的有機物和懸浮固體含量都(du)有所增(zeng)加。過濾後的自來水比未過濾的自來水對滅(mie)活作用更強(qiang)。

此外，HCoV在未過濾的一級出水中的存活時間比過濾後的長。這表明較高的固體含量確(que)實(shi)為水中的冠狀病毒提供了保(bao)護。然而，對PV-1來說，過濾對其在自來水中的存活影響(xiang)很(hen)小。在一級出水中，經過濾出水中的PV-1存活時間是未經過濾出水中的三(san)倍。

值得注意的是，在添(tian)加到廢水中的時間和立即回收用於測試(shi)的時間(零時間點)之間，冠狀病毒的效價顯(xian)著降低。加入廢水後，冠狀病毒的效價立即下降了99.9%，而PV-1效價僅(jin)下降了10%。這種減少可(ke)能是由於廢水中溶劑(ji)和洗滌劑(ji)的存在，它們會破(po)壞病毒包膜並最終使病毒失活。

這也(ye)可(ke)能表明冠狀病毒比PV-1更容(rong)易吸(xi)附廢水中的固體。病毒包膜的疏水性使得冠狀病毒在水中的溶解性降低，因此增(zeng)加了這些病毒粘(zhan)附在固體上的可(ke)能性。廢水樣本必(bi)須經過過濾，以防止細菌汙染細胞單層，這將去除顆粒物和任何(he)與之相關的病毒。

捕食性微生物如原生動物的存在可(ke)以增(zeng)加水中病毒的失活率，蛋白酶和核酸酶也(ye)有這種作用(Gerba et al. 1978; John and Rose 2005)。與二級出水相比，初級出水的細菌和固體含量都(du)較高。

所有三(san)種測試(shi)病毒在未過濾的初級出水中的存活時間都(du)比未過濾的二級出水長，盡管對FIPV來說這是可(ke)以忽略的。這再次表明，廢水中的顆粒物相關病毒受到保(bao)護，不會被捕食和滅(mie)活。然而，冠狀病毒在3天後低於最低檢測限(xian)，而PV-1在21天後仍(reng)可(ke)檢測到。廢水中研究病毒的平均對數減少結果列於表2。

04結論

這項(xiang)研究的結果表明，冠狀病毒比PV-1對溫度更敏感，並且PV-1和冠狀病毒在廢水中的存活性有相當大的差異(yi)。其部分可(ke)能原因是包膜病毒在環(huan)境(jing)中不如非包膜病毒穩定。冠狀病毒在廢水中很(hen)快死亡，在2～3天內減少了99.9%，這與SARS-CoV存活數據相當(Wang et al. 2005a, b)。

冠狀病毒在初級出水中的存活時間僅(jin)略長於二級出水，這可(ke)能是因為懸浮固體含量較高，可(ke)以防止其失活。PV-1比冠狀病毒存活時間長得多，初級出水需要10天，二級出水需要5天，才能達到與冠狀病毒相當的滅(mie)活率。本研究表明，冠狀病毒在水環(huan)境(jing)中的傳(chuan)播要比腸(chang)道病毒少，因為在環(huan)境(jing)溫度下，冠狀病毒在水中和廢水中會更快地失活。